| Sumario: | En este trabajo se diseñó y construyó un microscopio multilínea basado en la técnica de light sheet fluorescence microscopy (LSFM) para cuantificar observables morfológicos y moleculares en organismos durante el desarrollo embrionario. Esta técnica se basa en la generación de planos de luz muy finos para obtener seccionamiento óptico, uno de los requisitos fundamentales para poder observar muestras en tres dimensiones. Por su configuración óptica, los microscopios LSFM se caracterizan por alcanzar velocidades de adquisición mucho más rápidas que las técnicas clásicas de barrido como la microscopía confocal, con niveles de daño biológico mucho más bajos y la posibilidad de hacer adquisiciones desde varios puntos de vista. Esto hace que la técnica sea ideal para el estudio de organismos vivos durante tiempos largos. El microscopio construido consiste de una etapa de combinación de láseres de distintas longitudes de onda, una etapa de iluminación y otra de detección. En la primera se acoplan tres láseres a una fibra óptica monomodo con el objetivo de filtrar espacialmente el haz y lograr mayor estabilidad mecánica. En la etapa de iluminación se utiliza una lente cilíndrica para generar un plano de luz, que es enfocado sobre una muestra fluorescente utilizando un objetivo de microscopio. En la detección, un segundo objetivo (ortogonal al de iluminación) colecta la fluorescencia emitida por la muestra. Esta fluorescencia es enfocada en el sensor de una cámara sCMOS mediante una lente de tubo. Se desarrolló un software en Python que a través de una interfaz gráfica permite controlar todos los componentes del microscopio y automatizar experimentos de manera flexible. Para validar la versatilidad del microscopio, se observaron embriones vivos de distintos organismos. Se realizó una serie temporal del desarrollo de un embrión de pez Medaka desde un estadío de cuatro células y durante 24 horas. Se registró la dinámica del latido cardíaco de un embrión de pez Medaka con una resolución temporal de 50 ms. Se observó el desarrollo de embriones de moscas de la fruta desde dos puntos de vista desde algunas horas después de la fertilización hasta la formación de larvas. Se utilizó el microscopio construido para estudiar el proceso de gastrulación de embriones de Xenopus laevis, en el que un grupo de células migran e ingresan en el labio dorsal del blastoporo. Esto se realizó en colaboración con el grupo de la Dra. María Cecilia Cirio (IFIBYNE - CONICET). Dada la profundidad a la que ocurren estos fenómenos, esta información no hubiera sido posible de obtener utilizando microscopía confocal. Se tomaron stacks tridimensionales de imágenes de estos procesos migratorios y se segmentaron y siguieron a través del tiempo células individuales durante tiempos del orden de seis horas. Este gran volumen de datos fue analizado utilizando algoritmos de diseño propio en Python para cuantificar descriptores morfológicos y velocimétricos del organismo durante el proceso observado. Esto se realizó para embriones en los que se indujo una pérdida de función de la proteína Furry y en embriones control. A partir del seguimiento de células individuales a través del tiempo fue posible determinar que en estos embriones las células migran con menor velocidad y persistencia que en embriones control. Se desarrolló un método basado en triangulaciones de Delaunay para estimar la distancia entre células vecinas a partir de la distancia entre los núcleos celulares. Esto mostró que se produce una acumulación de células cerca del labio dorsal del blastoporo en embriones con pérdida de función de Furry. Con el objetivo de cuantificar la actividad molecular de observables biológicos, se le agregó al microscopio la capacidad de hacer mediciones de anisotropía de polarización para determinar el estado de biosensores. Esta técnica se utilizó para hacer las primeras mediciones de una nueva línea transgénica de moscas de la fruta que expresa un sensor de homoFRET de actividad de caspasas. Las caspasas son una familia de proteasas que tiene un rol clave en el correcto funcionamiento de la muerte celular programada. El sensor consta de dos fluoróforos iguales unidos por una secuencia que la caspasa Drice reconoce como sitio de clivaje. Como consecuencia, cuando una célula entra en estado apoptótico y produce Drice, el sensor se cliva. Esto resulta en un cambio en la polarización de la fluorescencia de emisión. Para poder detectar dicho cambio, se agregó un OptoSplit en el camino de detección. Este dispositivo permite dividir la imagen en dos e introducir elementos ópticos (en este caso polarizadores) en cada camino. También se ensayó el uso de una rueda doble de filtros de fluorescencia y polarización. Para analizar las imágenes resultantes, se escribió un algoritmo que permite elegir áreas correspondientes a las imágenes de cada polarización. Una vez hecho esto, el software alinea las imágenes y calcula las imágenes de anisotropía. Se agregó al microscopio un LED ultravioleta que permite irradiar muestras para inducir muerte celular. Se realizó un experimento piloto irradiando embriones de la línea transgénica generada, en los que se detectó un aumento global en la anisotropía luego de la irradiación. En conclusión, se diseñó y construyó un microscopio LSFM con capacidad de estudiar cuantitativamente observables biológicos fenotípicos y moleculares en distintos organismos. Según nuestro conocimiento, este es el único microscopio LSFM disponible en el país. Se desarrolló un software propio de control y automatización de experimentos, así como también algoritmos de análisis de grandes volúmenes de datos. Utilizando estas herramientas, se estudió el proceso de gastrulación de Xenopus laevis, encontrándose que en los embriones con pérdida de función de la proteína Furry las células migran con menor velocidad y persistencia, y presentan un agrupamiento cerca del labio dorsal que no se observa en embriones control. Se le agregó al microscopio la capacidad de hacer mediciones de homoFRET por anisotropía de polarización y se realizaron las primeras mediciones de actividad de la caspasa Drice en embriones vivos de moscas de la fruta.
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