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|a La retina de los peces �oseos, a diferencia de la retina de los mam�iferos, posee c�elulas progenitoras multipotentes que proliferan a lo largo de toda la vida del animal, originando todos los tipos celulares retinianos, que se agregan al tejido diferenciado a medida que �este crece. Este crecimiento ocurre en una regi�on histol�ogicamente distinguible, ubicada entre la retina neural y el epitelio ciliar, denominada zona ciliar marginal (CMZ), cuyas c�elulas poseen capacidad proliferativa. Esta zona representa un anillo de tejido, alrededor de la retina madura, donde existe un gradiente de diferenciaci�on celular, que comprende tanto stem cells (m�as perif�ericas) como c�elulas progenitoras ya comprometidas con determinados fenotipos retinianos (m�as centrales). Una caracter�istica sorprendente de la retina adulta de pez es que posee la capacidad de regenerarse completamente en respuesta al da�no. Por consiguiente, la retina de este vertebrado ofrece caracter�isticas �unicas para el estudio de los factores extracelulares e intracelulares que dirigen la proliferaci�on celular y que llevan a la regeneraci�on del tejido adulto. Tanto algunas neuronas como c�elulas gliales de la retina, as�i como tambi�en las c�elulas del epitelio pigmentario, liberan ATP hacia el espacio extracelular, donde �este, o sus productos de hidr�olisis, act�uan como neurotransmisores, o neuromoduladores, a trav�es de su uni�on a receptores purin�ergicos espec�ificos. La liberaci�on de ATP puede producirse en respuesta a diversos est�imulos fisiol�ogicos, ya sea mec�anicos, qu�imicos, osm�oticos o el�ectricos, o en respuesta a condiciones patol�ogicas como la hipoxia, deshidrataci�on, neurodegeneraci�on o frente a una lesi�on. Los nucle�otidos extracelulares, adem�as de interactuar de manera aut�ocrina o par�acrina con receptores purin�ergicos de membrana, son hidrolizados por ectonucleotidasas presentes en la membrana plasm�atica. Entre estas enzimas, una familia importante se denomina ectonucle�osido trifosfato difosfohidrolasa (E-NTPDasa). La actividad de estas enzimas no s�olo garantiza la finalizaci�on del est�imulo inducido por los nucle�otidos extracelulares, sino que adem�as posibilita la conversi�on de unos nucle�otidos en otros, por ejemplo, ATP a ADP, �este a AMP y luego a adenosina, o UTP a UDP. Estos productos de hidr�olisis, a su vez, presentan diferente afinidad por distintos receptores, provocando diversas respuestas intracelulares. El conjunto de nucle�otidos y nucle�osidos extracelulares, receptores y NTPDasas se conoce como sistema de se�nalizaci�on purin�ergica. En esta tesis doctoral, se realiz�o una caracterizaci�on detallada del posible rol regulatorio de las se�nales purin�ergicas sobre la capacidad proliferativa y regenerativa de la retina adulta de pez cebra en respuesta al da�no. Se utilizaron dos modelos de da�no de tipo citot�oxico, uno que provoca una lesi�on parcial del tejido, generando muerte celular solamente en las capas internas de la retina (interneuronas y c�elulas ganglionares), y otro que causa una lesi�on global, que involucra a todos los tipos celulares retinianos, incluyendo a los fotorreceptores. En primer lugar, se describi�o que una lesi�on citot�oxica con ouaba�ina, ya sea parcial o global, indujo la activaci�on mit�otica de las c�elulas proliferativas presentes tanto en el tejido maduro diferenciado como en la CMZ, alcanz�andose un pico de m�axima proliferaci�on a los 7 d�ias luego de la lesi�on. Adem�as, se evidenci�o un importante rol de los nucle�otidos extracelulares en la regulaci�on de esta activaci�on mit�otica luego de la inducci�on de ambos tipos de lesi�on, ya que el tratamiento con un exceso de enzimas que hidrolizan nucle�otidos extracelulares disminuy�o significativamente el m�aximo aumento de proliferaci�on celular. Asimismo, el tratamiento con MRS2179 (un antagonista de los receptores purin�ergicos metabotr�opicos P2Y1 con alta afinidad por el ADP) disminuy�o significativamente el pico de proliferaci�on celular inducido por la lesi�on (tanto parcial como global) de la retina. Es interesante destacar que retinas no lesionadas y tratadas con un an�alogo poco hidrolizable del ADP presentaron un aumento significativo de la actividad proliferativa tanto en las capas de tejido maduro como en la CMZ. Estos resultados indicaron que el ADP es una se�nal suficiente para inducir activaci�on mit�otica de los precursores retinianos a�un en ausencia de da�no. El efecto del ADP en el tejido intacto fue tambi�en inhibido completamente por un antagonista del receptor P2Y1. Se observ�o tambi�en que los nucle�otidos extracelulares son fundamentales para la reparaci�on del tejido, ya que retinas lesionadas y posteriormente tratadas con apirasa o MRS2179 mostraron un mayor grado de desorganizaci�on tisular y desaparici�on nuclear en todas las capas retinianas, en comparaci�on con retinas lesionadas. El grado de regeneraci�on de las retinas da�nadas y sometidas posteriormente a los tratamientos mencionados exhibi�o un retardo con respecto al tejido lesionado y en regeneraci�on en presencia de se�nalizaci�on purin�ergica end�ogena. Asimismo, se observ�o que el tratamiento de retinas lesionadas con ARL67156, un inhibidor selectivo de las ecto-ATPasas, disminuy�o significativamente el incremento de proliferaci�on celular, evidenciando la importancia de la actividad de las NTPDasas en la regulaci�on de la proliferaci�on celular inducida por la lesi�on del tejido. Por otra parte, se evidenci�o un importante rol de los nucle�otidos extracelulares en la regulaci�on de la muerte celular inducida por la lesi�on, ya que la remoci�on enzim�atica de estos nucle�otidos increment�o significativamente este proceso. Este efecto fue reproducido al bloquear los receptores P2Y1, sugiriendo un rol neuroprotector del ADP, particularmente sobre los fotorreceptores retinianos. Estos resultados sugirieron que las se�nales purin�ergicas son capaces de atenuar significativamente los efectos de la lesi�on citot�oxica sobre la muerte neuronal y glial. Posteriormente, se observ�o que el nivel de expresi�on del ARNm de las NTPDasas 1, 2mq, 2mv, y 3 aument�o significativamente luego de inducida la lesi�on. En concordancia, el patr�on espacial de expresi�on de la prote�ina NTPDasa2 sufri�o importantes cambios luego de la inducci�on de la lesi�on. Finalmente, se describi�o la expresi�on del receptor P2Y1 en la retina de pez cebra. El nivel de su ARNm, as�i como su expresi�on proteica, aumentaron de manera significativa luego de inducida la lesi�on citot�oxica con ouaba�ina. Se observ�o adem�as, mediante la t�ecnica de western blot, un cambio en el patr�on de expresi�on en las etapas de degeneraci�on y proliferaci�on, luego de lesionar el tejido retiniano.
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