Optimización de la capacidad fecundante de espermatozoides criopreservados mediante la manipulación de vías de señalización molecular: influencia de la modulación del sistema endocannabinoide y de la aplicación del protocolo SER en equinos y bovinos
The use of reproductive biotechnologies is a cornerstone of the livestock industry. In recent years, in vitro embryo production has shown a steady increase due to advances in the implementation of techniques such as conventional in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI...
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| Otros Autores: | |
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| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias
2025
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Espermatozoides Capacitación Equino Bovino Sistema endocannabinoide Restricción energética y recuperación SER Hambreado Bitoecnologías reproductivas Spermatozoa Capacitation Equine Bovine Endocannabinoid system Energy restriction and recovery SER Starvation Reproductive biotechnologies Capacitación espermática Fecundación in vitro Reproducción Ciencias Veterinarias |
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Espermatozoides Capacitación Equino Bovino Sistema endocannabinoide Restricción energética y recuperación SER Hambreado Bitoecnologías reproductivas Spermatozoa Capacitation Equine Bovine Endocannabinoid system Energy restriction and recovery SER Starvation Reproductive biotechnologies Capacitación espermática Fecundación in vitro Reproducción Ciencias Veterinarias Arroyo Salvo, Camila Andrea Optimización de la capacidad fecundante de espermatozoides criopreservados mediante la manipulación de vías de señalización molecular: influencia de la modulación del sistema endocannabinoide y de la aplicación del protocolo SER en equinos y bovinos |
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The use of reproductive biotechnologies is a cornerstone of the livestock industry. In recent years, in vitro embryo production has shown a steady increase due to advances in the implementation of techniques such as conventional in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Sperm quality is a key factor for achieving optimal fertilization and in vitro embryonic development rates. Treatments that enhance fertilizing capacity by incubating sperm in appropriate media allow the evaluation of sperm parameters as potential predictors of fertilization rates and embryo quality.
Numerous studies have focused on identifying molecules capable of improving sperm competence for their use in IVF or ICSI techniques.
In equines, conventional IVF shows limited efficiency. Studies reporting the birth of foals through this technique emphasize the need for high-quality sperm samples. In the case of cryopreserved sperm, selection and incubation protocols must be adapted to achieve optimal fertilization rates. For this reason, ICSI remains the technique of choice for in vitro embryo production in equines.
In contrast, in bovines, ICSI is inefficient in achieving adequate fertilization and embryonic development rates. While conventional IVF yields high cleavage rates, its efficiency in supporting embryonic development remains low.
This thesis aimed to optimize the fertilizing capacity of cryopreserved equine and bovine sperm through the manipulation of molecular signaling pathways. In the first chapter, specific incubation conditions were evaluated and established for cryopreserved equine sperm, as the published information for these samples was scarce.
Our results demonstrated that incubating cryopreserved equine sperm in a bicarbonate- and PVA-enriched medium at a pH of 7.5, 38.5 °C, for 45 minutes, induces key molecular events associated with sperm capacitation. These include an increase in cAMP, elevated levels of pPKA (PKA-phosphorylated substrates) and tyrosine phosphorylation (pY), increased intracellular calcium, enhanced hyperactivation parameters, and the occurrence of the acrosome reaction. These conditions supported optimal activation, cleavage, and embryonic development rates following ICSI in porcine, bovine, and equine oocytes.
Additionally, this work characterized, for the first time, the endocannabinoid system in equine sperm, identifying CB1, TRPV1, and GPR55 receptors. Adding anandamide (AEA) to the capacitating medium developed in this study did not significantly affect sperm parameters compared to the use of the medium alone. However, incubating sperm with AEA in a non-capacitating medium increased pY levels. Moreover, the use of a GPR55 receptor antagonist reduced pY levels under capacitating conditions, suggesting a potential role for this receptor in equine sperm capacitation,
though further studies are required to confirm its involvement.
In the second chapter, the effects of the SER protocol (Sperm Energy Restriction and Recovery) were explored. This protocol involves the transient starvation of sperm followed by the restitution of energy sources. In bovine sperm, starvation did not affect motility, which remained active, suggesting the utilization of endogenous energy reserves. Energy restitution after starvation increased total and progressive motility compared to controls.
In equines, starvation ceased sperm motility within 20 minutes, accompanied by a decrease in mitochondrial membrane potential, both of which were restored after the reintroduction of energy sources, alongside an increase in hyperactivated motility. Additionally, in equine sperm, starvation induced an increase in intracellular calcium levels and the percentage of the acrosome reaction, parameters that returned to baseline after energy restitution.
In conclusion, cryopreserved equine sperm requires specific incubation conditions to induce capacitation, and the endocannabinoid system may be involved through the GPR55 receptor. Additionally, the SER protocol showed species-specific effects in bovine and equine sperm, highlighting the metabolic particularities of each species. These strategies offer a promising approach to improving IVF and ICSI protocols, optimizing outcomes in equines and bovines. |
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In the case of cryopreserved sperm, selection and incubation protocols must be adapted to achieve optimal fertilization rates. For this reason, ICSI remains the technique of choice for in vitro embryo production in equines. In contrast, in bovines, ICSI is inefficient in achieving adequate fertilization and embryonic development rates. While conventional IVF yields high cleavage rates, its efficiency in supporting embryonic development remains low. This thesis aimed to optimize the fertilizing capacity of cryopreserved equine and bovine sperm through the manipulation of molecular signaling pathways. In the first chapter, specific incubation conditions were evaluated and established for cryopreserved equine sperm, as the published information for these samples was scarce. Our results demonstrated that incubating cryopreserved equine sperm in a bicarbonate- and PVA-enriched medium at a pH of 7.5, 38.5 °C, for 45 minutes, induces key molecular events associated with sperm capacitation. These include an increase in cAMP, elevated levels of pPKA (PKA-phosphorylated substrates) and tyrosine phosphorylation (pY), increased intracellular calcium, enhanced hyperactivation parameters, and the occurrence of the acrosome reaction. These conditions supported optimal activation, cleavage, and embryonic development rates following ICSI in porcine, bovine, and equine oocytes. Additionally, this work characterized, for the first time, the endocannabinoid system in equine sperm, identifying CB1, TRPV1, and GPR55 receptors. Adding anandamide (AEA) to the capacitating medium developed in this study did not significantly affect sperm parameters compared to the use of the medium alone. However, incubating sperm with AEA in a non-capacitating medium increased pY levels. Moreover, the use of a GPR55 receptor antagonist reduced pY levels under capacitating conditions, suggesting a potential role for this receptor in equine sperm capacitation, though further studies are required to confirm its involvement. In the second chapter, the effects of the SER protocol (Sperm Energy Restriction and Recovery) were explored. This protocol involves the transient starvation of sperm followed by the restitution of energy sources. In bovine sperm, starvation did not affect motility, which remained active, suggesting the utilization of endogenous energy reserves. Energy restitution after starvation increased total and progressive motility compared to controls. In equines, starvation ceased sperm motility within 20 minutes, accompanied by a decrease in mitochondrial membrane potential, both of which were restored after the reintroduction of energy sources, alongside an increase in hyperactivated motility. Additionally, in equine sperm, starvation induced an increase in intracellular calcium levels and the percentage of the acrosome reaction, parameters that returned to baseline after energy restitution. In conclusion, cryopreserved equine sperm requires specific incubation conditions to induce capacitation, and the endocannabinoid system may be involved through the GPR55 receptor. Additionally, the SER protocol showed species-specific effects in bovine and equine sperm, highlighting the metabolic particularities of each species. These strategies offer a promising approach to improving IVF and ICSI protocols, optimizing outcomes in equines and bovines. Fil: Arroyo Salvo, Camila Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina Gambini, Andrés Pérez Martínez, Silvina Arroyo Salvo, Camila Andrea 2025-05-27 El uso de biotecnologías reproductivas es un pilar fundamental en la industria pecuaria. En los últimos años, la producción de embriones in vitro ha mostrado un aumento constante debido a los avances en la implementación de técnicas como la fecundación in vitro convencional (FIV) y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La calidad de los espermatozoides es un factor clave para alcanzar tasas óptimas de fecundación y desarrollo embrionario in vitro. Los tratamientos que optimizan la capacidad fecundante mediante la incubación de espermatozoides en medios adecuados permiten evaluar parámetros espermáticos como posibles predictores de las tasas de fecundación y la calidad embrionaria. Diferentes investigaciones han puesto el foco en la búsqueda de moléculas que puedan mejorar la competencia espermática para ser utilizados en las técnicas de FIV o ICSI. En equinos, la FIV convencional presenta una eficiencia limitada. Los estudios que han reportado el nacimiento de potrillos mediante esta técnica destacan la necesidad de utilizar muestras espermáticas de alta calidad. En el caso de los espermatozoides criopreservados, los protocolos de selección e incubación deben adaptarse para alcanzar tasas óptimas de fecundación. Por esta razón, la técnica de elección para la producción de embriones in vitro en equinos sigue siendo la ICSI. En contraste, en bovinos, la ICSI resulta ineficiente para alcanzar tasas adecuadas de fecundación y desarrollo embrionario. Aunque la FIV convencional permite obtener altas tasas de clivaje, la eficiencia en el desarrollo embrionario sigue siendo baja. Esta tesis tuvo como objetivo optimizar la capacidad fecundante de los espermatozoides criopreservados de equinos y bovinos mediante la manipulación de vías de señalización molecular. En el primer capítulo, se evaluaron y establecieron las condiciones específicas de incubación para espermatozoides equinos criopreservados, ya que la información publicada para este tipo de muestras era escasa hasta el momento. Nuestros resultados demostraron que la incubación de los espermatozoides equinos criopreservados en un medio con bicarbonato y PVA, a un pH de 7,5, a 38,5 °C durante 45 minutos, induce eventos moleculares claves asociados a la capacitación espermática, como el aumento de AMPc, el incremento de los niveles de sustratos fosforilados por PKA (pPKA) y de fosforilación de tirosinas (pY), el aumento del calcio intracelular, el aumento de los parámetros de hiperactivación y la ocurrencia de la reacción acrosomal. Estas condiciones permitieron obtener buenas tasas de activación, clivaje y desarrollo embrionario luego de una ICSI en ovocitos de cerdo, bovino y equino. Además, en este trabajo se caracterizó por primera vez el sistema endocannabinoide en espermatozoides equinos, identificando los receptores CB1, TRPV1 y GPR55. La adición de anandamida (AEA) al medio capacitante, desarrollado en este trabajo, no mostró efectos significativos en comparación con el uso del medio capacitante solo. Sin embargo, la incubación de los espermatozoides con AEA en un medio no capacitante indujo un incremento de los niveles de pY. Asimismo, la incubación con un antagonista del receptor GPR55 redujo los niveles de pY observados en condiciones capacitantes, sugiriendo que este receptor podría participar en la capacitación espermática equina, aunque se requieren estudios adicionales para confirmar su rol. En el segundo capítulo, se exploró el efecto del protocolo SER (del inglés, ?Sperm Energy Restriction and Recovery?), que consiste en el hambreado transitorio de los espermatozoides seguido de la restitución de las fuentes de energía. En espermatozoides bovinos, el hambreado no afectó la motilidad, que se mantuvo activa, lo que sugiere el uso de reservas energéticas endógenas. La restitución energética tras el hambreado aumentó la motilidad total y progresiva en comparación con los controles. En espermatozoides equinos, el hambreado detuvo la motilidad a los 20 minutos, concomitante con una disminución del potencial de membrana mitocondrial, los cuales se recuperaron tras la reincorporación de los sustratos de energía, junto con un incremento en la motilidad hiperactivada. Además, en equinos, el hambreado indujo un aumento en los niveles de calcio intracelular y en el porcentaje de reacción acrosomal, parámetros que regresaron a niveles normales tras la restitución. En conclusión, los espermatozoides equinos criopreservados requieren condiciones de incubación específicas para inducir la capacitación espermática, y el sistema endocannabinoide podría estar involucrado a través del receptor GPR55. Además, el protocolo SER mostró efectos diferenciados en espermatozoides bovinos y equinos, resaltando las particularidades metabólicas de cada especie. Estas estrategias ofrecen un enfoque prometedor para mejorar los protocolos de FIV e ICSI, optimizando los resultados en equinos y bovinos. application/pdf Espermatozoides Capacitación Equino Bovino Sistema endocannabinoide Restricción energética y recuperación SER Hambreado Bitoecnologías reproductivas Spermatozoa Capacitation Equine Bovine Endocannabinoid system Energy restriction and recovery SER Starvation Reproductive biotechnologies spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/2.5/ar/ Capacitación espermática Fecundación in vitro Reproducción Ciencias Veterinarias Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias Optimización de la capacidad fecundante de espermatozoides criopreservados mediante la manipulación de vías de señalización molecular: influencia de la modulación del sistema endocannabinoide y de la aplicación del protocolo SER en equinos y bovinos info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=avaposgra&cl=CL1&d=HWA_8045 https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/avaposgra/index/assoc/HWA_8045.dir/8045.PDF |