Biosíntesis de succinoglicano y de compuestos relacionados en Agrobacterium radiobacter

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Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Bassi, Daniel Ernesto
Otros Autores:	Dankert, Marcelo A.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1996
Materias:	BIOSINTESIS POLISACARIDOS SUCCINOGLICANO AGROBACTERIUM BIOSYNTHESIS POLYSACCHARIDES SUCCINOGLYCAN
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2879_Bassi https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2879_Bassi_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con [14C]-Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP-[14C]-Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP-[14C]-Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens.
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spelling	I28-R145-tesis_n2879_Bassi_oai2024-09-02 Dankert, Marcelo A. Bassi, Daniel Ernesto 1996 Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con [14C]-Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP-[14C]-Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP-[14C]-Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens. Agrobacterium radiobacterium produces an extracellular polysaccharide (EPS), succinoglycan, containig an octasaccaharide repeating unit (R.U.) constituted with Glc, Gal, piruvate and succinate in a 7:1:1:1 molar ratio (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal--4-6-4Pyr. This polysaccharide is widely used in the oil industry, and Agrobacterium radiobacter is regularly employed to produce it because of the good yields reached. As it was demonstrated for other systems, the biosynthesis of the EPS takes place mainly in four stages (Ielpi et al, 1993, J.Bacteriol. 175:2490-2500). In the first one, the donor sugar nucleotides are synthesized. In a second stage, the R.U. is made by the secuential transfer of the different monosaccharides that constitute it, from the proper sugar nucleotides, to a plasmatic membrane bound prenyl phosphate. Once the R.U. is completed, it acts as a monomer in a polymerization reaction, the EPS being the final product. It is likely that polimerization and the transport to the extracellular compartment (fourth stage) are simultaneous. In this study, the "in vitro" biosynthesis of succinoglycan in A. radiobacter is described. Some intermediate prenyl phospho sugars and the final product, the "in vitro" synthesised succinoglycan were obtained. In order to search for the posible formation of compounds related to the synthesis of polysaccharide, incubations with EDTA permeated cells (García et al., 1974, Eur. J. Biochem.43:93-105) in the presence of UDP-Glc and/or UDP-Gal, one of them radioactively labelled, were performed. The reactions were ended by dilution and centrifugation and the cell pellet was washed several times with buffer and then extracted with organic solvents, that dissolve the lipid-sugars. The presence of EPS was investigated in the combined supernatants and washings. When the incubations were done using wild type cells, in the presence of UDP-[14C]-Glc several lipidic compounds were obtained, some with unusual properties, but none of them behaved as expected for prenyl-phospho-sugars. However, polymer was observed in the aqueous supernatant though in very low amounts. When incubating in the presence of UDP-[14C]-Gal, it could be found some compounds of our interest, one of them liberating Gal, but in quantities not suitable to be analized. Incubations done in the presence of both nucleotides, one of them radioactively labelled, yielded smaller amounts of radioactivity soluble in organic solvents, probably because of the dilution of the labell, due to the activity of UDP-Gal-4-epimerase, the enzime which catalizes the interconversion of UDP-Glc into UDP-Gal. The idea was then to look for a mutant defective in this enzyme activity to be able to perform incubations in the presence of both sugar nucleotides, one of them labelled, in order to avoid this dilution effect. As expected, the synthesis of compounds with the properties of prenylphosphosugars was achieved when the SGN-1 strain, a mutant not able to synthesise the UDP-Gal-4-epimerase, was used as enzime source. The following compounds were characterized: Gal-P-P-prenol; (cellobiosyl)-galactose-P-P- prenol , and the prenyl diphosphate derivatives of an octasaccharide and of its pyruvilated octasaccharide closely related to the structure of the R.U. of succinoglycan. The amount of radioactive labelled polymer was significatively higher and could be identified as succinoglycan. Performing two steps incubations, it was demonstrated that the prenyl-phospho-sugars were the precursors of the EPS. On the other hand, the effects of the non glycosidic donors on the polymer synthesis was studied. Phosphoenolpyruvate stimulates moderately polymer formation, probably due to the rise in the amounts of the pyruvulated R.U., which is apparently a more adequate sustrate for the polimerase. Succinyl coenzyme A excerts a dual effect. At concentrations of 0,1 mM greatly enhances the polimerization, but with a tenfold increase (1 mM) a reduction in the activation was observed. Finally these studies were extended to the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens, a closely related bacteria that also produces succinoglycan. Enzymatic preparations from this strain allowed the synthesis of several prenyl-phospho sugars, but no polymerization was observed (Staneloni et al, 1984 J. Gen. Microbiol, 130: 869- 879). With the experience acquired with A. radiobacter system, "in vitro" succinoglycan synthesis was also obtained. Fil: Bassi, Daniel Ernesto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2879_Bassi spa Universidad de Buenos Aires. 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Biosíntesis de succinoglicano y de compuestos relacionados en Agrobacterium radiobacter

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