Comportamiento del veneno de Bothrops alternatus en la cromatografía de interacción hidrofóbica
Antecedentes. La cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) permite separar proteínas en base a su hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las biomoléculas a la superficie hidrofóbica de la resina en una solución fuertemente salina y su posterior elución mediante un grad...
Guardado en:
| Autores principales: | , , |
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| Formato: | Reunión |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad Nacional del Nordeste Secretaría General de Ciencia y Técnica
2024
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/56106 |
| Aporte de: |
| Sumario: | Antecedentes. La cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) permite separar proteínas en base a su
hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las biomoléculas a la superficie hidrofóbica de la resina
en una solución fuertemente salina y su posterior elución mediante un gradiente salino negativo. Es de interés
combinar la separación de proteínas por este principio con otros métodos no convencionales como es la extracción
líquido-líquido con sistemas bifásicos acuosos (SBA) y la precipitación con polielectrolitos insolubles (previamente
aplicados con éxito a la purificaciones de toxinas ofídicas específicamente fosfolipasas) para aumentar el número de
proteínas a purificar y a la vez mejorar la calidad de las previamente aisladas.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la separación de componentes proteicos del veneno de Bothrops alternatus,
mediante cromatografía de interacción hidrofóbica de proteínas con el fin de reunir conocimiento de la distribución
global de sus componentes en este tipo de columna, y compararlo con el perfil que genera un extracto pre-purificado
de toxinas de este veneno proveniente de la combinación de tamiz molecular, SBA y precipitación mediante adsorción
con DEAE-celulosa.
Materiales y métodos. El veneno de B. alternatus (15 mg/ml, 1ml) se eluyó en una columna HiTrap Butyl FF, en buffer
Sulfato de amonio 1M, para luego ser expuesto a un gradiente discontinuo decreciente en fuerza iónica (0.75 M, 0.50
M, 0.25 M, agua destilada). Se testearon en cada fracción las actividades relacionadas con las toxinas principalmente
responsables de la intoxicación: proteolítica (sobre azocaseína), fosfolipásica (en placa de agar sangre enriquecida
con lecitina de huevo) y coagulante (sobre plasma citratado). El contenido proteico se estimó por técnica de Bradford
y se controló por SDS-PAGE el perfil electroforético de cada pico resultante de la elución con cada solución salina.
Este mismo procedimiento se llevó a cabo sobre una muestra obtenida de la combinación de: 1° etapa tamiz
molecular (100 mg veneno/ml, 500 uL, aplicado a columna de Sephadex G-75), 2° etapa reparto por SBA (pool de pico
2 del Seph. G-75 aplicado al sistema bifásico PEG3350/Pi 30% pH7) y 3° etapa Precipitación con Polielectrolitos
insolubles (fase superior incubada en batch con DEAE celulosa y luego eluida con buffer Pi 10mM 1M NaCl).
Resultados. El perfil cromatografico de elución para el veneno por HIC entero mostró a través de los 5 picos
resultantes, la posibilidad de recoger de modo selectivo los diferentes componentes, así, a las mayores fuerzas iónicas
eluyeron principalmente las enzimas del tipo trombina, con hidrofobicidad intermedia eluyeron las proteolíticas
mientras que las fosfolipasas mostraron la mayor hidrofobicidad eluyendo a la menor fuerza iónica (con 0,25 M y con
agua destilada). El ensayo por SDS-PAGE mostró la presencia de varias bandas aunque una predominante. El perfil
de elución del extracto proteico, libre de metaloproteasas y resultante de 3 procesos separativos previos, fue
comparable al del veneno, permitió obtener a una fuerza iónica de 0,75M enzimas con actividad coagulante y a 0,25M,
aquellas con actividad fosfolipásica, que por SDS-PAGE se resolvió en una banda homogénea.
Conclusiones. La utilización de la columna de interacción hidrofóbica permite una adecuada separación de
componentes del veneno botrópico según su hidrofobicidad relativa, mostrando ser una herramienta apropiada para
combinar con otros procesos separativos tales como el reparto líquido-líquido (SBA) y la precipitación con
polielectrolitos insolubles (DEAE celulosa), para el aislamiento y purificación de proteínas ofídicas. |
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