Evaluación de la actividad antioxidante de de ingredientes derivados de caupí cultivado en el NEA
El caupí (Vigna unguiculata [L.] Walp., sinónimo: Vigna sinensis [L.]) es una legumbre perteneciente a la familia Fabaceae y en la actualidad se encuentra ampliamente distribuida en el mundo. Este cultivo se utiliza para la alimentación humana y animal, como cultivo de cobertura y rotación y como...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura
2025
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58637 |
| Aporte de: |
| Sumario: | El caupí (Vigna unguiculata [L.] Walp., sinónimo: Vigna sinensis [L.]) es una legumbre
perteneciente a la familia Fabaceae y en la actualidad se encuentra ampliamente distribuida en
el mundo. Este cultivo se utiliza para la alimentación humana y animal, como cultivo de
cobertura y rotación y como abono verde. Sus semillas son consideradas un alimento con un
elevado contenido de proteínas (23-27%), de buena calidad nutricional y fuente de aminoácidos
esenciales, vitaminas del complejo B y minerales.
Los radicales libres se forman en el organismo debido a una combinación de factores
ambientales y biológicos. Entre los factores ambientales se encuentran la exposición a
radiaciones, humo de cigarrillo, ozono, drogas químicas y pesticidas. En cuanto a los factores
biológicos, durante las reacciones metabólicas endógenas en las células aeróbicas, se generan
especies reactivas de oxígeno (ROS) como el anión superóxido (O2•-
), radical hidroxilo (OH•
),
radical peroxilo (ROO•
), radical hidroxiperoxilo (HOO•
), peróxido de hidrógeno (H2O2) y
peróxidos orgánicos, que son productos normales de la reducción biológica del oxígeno
molecular. La producción de radicales libres es un proceso natural que puede ocurrir con o sin
la intervención de enzimas, y sólo representa un problema de salud cuando los mecanismos de
defensa del organismo no son capaces de neutralizarlos adecuadamente.
Las acciones nocivas de los radicales libres sobre el organismo han promovido la
búsqueda de moléculas con propiedades antioxidantes como potenciales agentes terapéuticos,
unido a la creciente preocupación por los efectos tóxicos producidos por los antioxidantes
sintéticos utilizados en la preservación de alimentos; esto refuerza la urgencia de obtener
sustancias antioxidantes menos tóxicas y de amplia utilidad en las industrias alimentaria,
cosmética y farmacéutica. En este sentido, el caupí constituye una potencial fuente de
compuestos debido a que posee gran variedad de metabolitos secundarios como respuesta a
estímulos o condiciones ambientales, entre ellos, sustancias con capacidad captadora de
radicales libres tales como los compuestos fenólicos y que a partir de sus proteínas se pueden
generar péptidos antioxidantes que pueden limitar también el daño oxidativo, tanto en
alimentos preparados (usándolos como antioxidantes naturales), así como al proteger de la
oxidación a las células del organismo cuando éstos son ingeridos en la dieta.
El objetivo general de esta tesis fue generar nuevos conocimientos sobre las propiedades
fisicoquímicas y biológicas antioxidantes de ingredientes derivados de caupí, de sus proteínas,
péptidos y compuestos fenólicos, a efectos de poder incorporarlos como suplemento o
ingrediente en productos alimentarios fabricados para fines específicos o bien su uso como
potenciales componentes benéficos para la salud. A partir de la harina de las semillas de caupí, se obtuvieron aislados proteicos por extracción alcalina (a pH 8,0 y 10,0) y posterior
precipitación isoeléctrica. Los aislados proteicos obtenidos se nombraron A8 y A10, de acuerdo
con el pH de extracción utilizado.
En primer lugar, se utilizaron dos relaciones diferentes de alcalasa y aislados para obtener
hidrolizados de proteínas de caupí con bajo (LH) o alto (HH) grado de hidrólisis (GH). Los
hidrolizados proteicos obtenidos se nombraron A8LH, A10LH, A8HH y A10HH. A efectos de
determinar los cambios estructurales de las proteínas como consecuencia de la hidrólisis
enzimática, se estudiaron el perfil polipeptídico y las características conformacionales de las
estructuras secundaria y terciaria. Los resultados obtenidos por electroforesis, cromatografía
de exclusión molecular, espectroscopias de fluorescencia e infrarrojo muestran que el
tratamiento con alcalasa para obtener un bajo GH afectó en mayor medida a A10 que a A8.
Mientras que para obtener un alto GH, se evidenciaron cambios fisicoquímicos y estructurales
donde no se evidenció incidencia del pH inicial de extracción de las proteínas. Además, los
hidrolizados LH presentaron un incremento de la solubilidad en la zona del punto isoeléctrico
de las proteínas.
Las moléculas antioxidantes pueden reaccionar mediante múltiples mecanismos, por lo
que fue importante evaluar la actividad antioxidante de los derivados del caupí utilizando
diferentes métodos (ABTS, ORAC y HORAC). A8LH y A10LH presentaron un aumento
similar de la actividad de eliminación de radicales (contra los radicales ABTS•+ y peroxilo) y
de la capacidad de prevenir la formación de radicales OH•, respecto a A8 y A10,
respectivamente. La capacidad antioxidante fue mayor a mayor GH alcanzado y se debió
principalmente a la presencia de péptidos de entre 1,8 y 6,5 kDa, obtenidos por fraccionamiento
mediante cromatografía de exclusión molecular, los cuales mostraron elevada actividad de
eliminación de radicales peroxilo. De la fracción cromatográfica de A10HH que presentó
mayor actividad antioxidante, se identificaron por espectrometría de masas péptidos trípticos
provenientes de cuatro proteínas de caupí. Consultando bases de datos de péptidos bioactivos
y teniendo en cuenta la especificidad de corte de la alcalasa, se lograron proponer secuencias
de péptidos antioxidantes provenientes de su hidrólisis.
Considernado que ambos aislados presentaron similar comportamiento en la solubilidad
y en las propiedades antioxidantes luego de la hidrólisis y, que la extracción a pH 10 de las
proteínas (más desnaturalizadas que a pH 8) facilitó la hidrólisis con alcalasa a bajas
concentraciones, se decidió continuar con la digestión gastrointestinal simulada (DGIS) del
aislado A10 y la harina de caupí. Se utilizó el método internacionalmente consensuado por la
acción COST INFOGEST (2019). La DGIS ocasionó menor grado de proteólisis en la harina (HD) que en el aislado proteico (A10D). Los perfiles electroforéticos y cromatográficos
mostraron una disminución o desaparición de las fracciones de mayor tamaño molecular,
generándose péptidos más pequeños y aminoácidos libres, cambios que se notaron en mayor
medida en A10D.
El proceso de DGIS produjo en HD y A10D un importante aumento de la capacidad de
eliminación de radicales (ABTS y peroxilo) y en la prevención de la oxidación del Fe2+
(FRAP). Si bien HD y A10D mostraron la capacidad de prevenir la formación de radicales OH•
(HORAC), la harina antes de la DGIS tuvo una actividad superior, indicando el aporte de
algunos componentes solubles activos (ausentes en el aislado). Adicionalmente, para estudiar
la actividad antioxidante intracelular en células Caco-2 TC7, se recurrió al uso de la resina
colestiramina a fin de remover previamente las sales biliares y obtener fracciones bioaccesibles
no citotóxicas de HD y A10D. Se demostró la inhibición del contenido de ROS en un 77% para
ambos digeridos, mostrando A10D una mayor actividad a una concentración 3 veces menor,
respecto de HD.
Los digeridos se sometieron a cromatografía de exclusión molecular para obtener
fracciones enriquecidas en péptidos con alta actividad antioxidante. En HD dos fracciones
(rango de PM entre 1,09 y 0,17 kDa) presentaron elevada actividad por ORAC mientras que
en A10D, la fracción con PM entre 1,1 y 0,68 kDa, mostró la mayor actividad por ABTS y
ORAC. A partir de las fracciones con PM entre 0,68 y 2,5 kDa que presentaron la mayor
actividad por el método de ORAC, se lograron identificar por espectrometría de masas,
secuencias de péptidos trípticos que provenían de la digestión de 11 y 24 proteínas de caupí,
halladas en los picos cromatográficos 3D de A10D y 4D A10D, respectivamente.
Para estudiar los compuestos fenólicos (CF) presentes en H y A10 y sus digeridos por
DGIS (HD y A10D) se obtuvieron extractos con distintos solventes: mezcla metanol:agua
70:30 (MA), metanol:HCl 1,2 M 50:50 (MH), y a partir de la mezcla de extracción metanolacetona-agua 7:7:6 (MAA) se obtuvieron las fracciones CFL (CF libres), CFE (CF
esterificados) y CFLP (CF ligados a proteínas). Se observó que el tipo y cantidad de CF
extraídos estuvo influenciado por los métodos de extracción. El contenido de CF totales
cuantificados por el método de Folin y la cantidad de CF identificados por RP-HPLC
presentaron diferencias ya que en H y en A10 existen otros compuestos no fenólicos capaces
de reaccionar con el reactivo Folin. En A10 hay mayor proporción de péptidos o aminoácidos
(respecto a H) que podrían reaccionar. En este sentido, si bien el contenido de CF totales no
presentó diferencias significativas respecto a la H en el extracto MA, se observó la pérdida de
algunos ácidos fenólicos y flavonoides solubles durante la preparación de A10 y, la cantidad cuantificada por RP-HPLC fue menor. Esto podría atribuirse a su solubilización o modificación
química en un medio alcalino, y/o a su absorción en la fracción insoluble. |
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