Estudios de Función y estructura en GumK, una glucuronosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del xantano
GumK es una glucuronosiltransferasa de Xanthomonas campestris involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido xantano, siendo la enzima encargada de adicionar el cuarto residuo de azúcar en la síntesis de la unidad repetitiva pentasacarídica de este polímero. Específicamente, GumK transfiere un re...
Guardado en:
| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2007
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4140_Barreras |
| Aporte de: |
| Sumario: | GumK es una glucuronosiltransferasa de Xanthomonas campestris involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido xantano, siendo la enzima encargada de adicionar el cuarto residuo de azúcar en la síntesis de la unidad repetitiva pentasacarídica de este polímero. Específicamente, GumK transfiere un residuo de ácido glucurónico a partir de su sustrato dador UDP-GlcA a su sustrato glicolipídico aceptor, polisoprenil-pirofosfato-glucosa-β-1,4-glucosa-α-1,3-manosa. Se caracterizó funcional y estructuralmente a GumK. La caracterización funcional se dio mediante la sobrexpresión, purificado y ensayos de actividad in vitro e in vivo de la enzima. Mediante estos ensayos de actividad se estudió la especificidad por sus sustratos. Asimismo se estudió su localización subcelular mediante fraccionamiento y detección por western blots. Al determinarse que esta enzima esta asociada a membranas, se realizaron experimentos de disociación para determinar el modo de unión a la membrana. Encontramos que interacciones hidrofóbicas y electrostáticas están involucradas en esta interacción. La caracterización estructural involucró la cristalización, colección de datos de difracción de rayos-X y resolución de la estructura de la proteína. La estructura fue resuelta con la información de fases proveniente de un experimento de dispersión anómala múltiple sobre un derivado de GumK con átomos de platino. La proteína mostró una estructura consistente de 2 dominios globulares tipo Rossmann, con una hendidura central que es el sitio de unión de sus sustratos y donde ocurre la catálisis. Además, y mediante experimentos de inmersión de cristales, logramos observar y describir el sitio y las interacciones que median la unión de la porción nucleotídica (UDP) del sustrato dador en la enzima. Para confirmar el rol de los residuos involucrados en la unión del UDP, realizamos mutagénesis sitio-dirigida y análisis de la cinética enzimática de las proteínas mutadas. Además realizamos estudios de complementación in vivo con estas mutantes. Estos análisis nos permitieron confirmar el rol de al menos media docena de residuos involucrados en la unión del sustrato dador y postular al aspartato 157 como un posible aminoácido catalítico. |
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