Diseño de nuevos vectores para la transformación de cloroplastos de tabaco y su aplicación para la expresión de ARNs doble cadena contra hemípteros fitófagos
La expresión a partir del genoma nuclear de ARNs doble cadena (ARNdc), en plantas, permite inducir silenciamiento génico en insectos que se alimentan de ellas. Sin embargo, esta estrategia se ve comprometida por la baja eficiencia de captación de ARNs pequeños interferentes por los animales. Por su...
Guardado en:
| Autor principal: | |
|---|---|
| Otros Autores: | , , , , , |
| Formato: | Tesis Libro |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
22 de Julio de 2022
|
| Materias: | |
| Aporte de: | Registro referencial: Solicitar el recurso aquí |
| LEADER | 10647nam a22005897a 4500 | ||
|---|---|---|---|
| 003 | AR-BaUEN | ||
| 005 | 20241024172452.0 | ||
| 008 | 220923s2022 ag ado|f m||| 000 0|spa d | ||
| 040 | |a AR-BaUEN |b spa |c AR-BaUEN | ||
| 041 | 0 | |b spa |b eng | |
| 044 | |a ag | ||
| 084 | |a BIO 007124 | ||
| 100 | 1 | |a Mirkin, Federico Gabriel | |
| 245 | 1 | 0 | |a Diseño de nuevos vectores para la transformación de cloroplastos de tabaco y su aplicación para la expresión de ARNs doble cadena contra hemípteros fitófagos |
| 246 | 3 | 1 | |a New vectors for chloroplast transformation and their application for the expression of long double stranded RNAs against phytophagous hemipterans |
| 260 | |c 22 de Julio de 2022 | ||
| 300 | |a 130 h. : |b il., fotos, gráfs. | ||
| 502 | |b Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |c Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |g CONICET. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres" (INGEBI) | ||
| 506 | |2 openaire |f info:eu-repo/semantics/embargoedAccess | ||
| 518 | |o Fecha de publicación en la Biblioteca Digital FCEN-UBA | ||
| 520 | 3 | |a La expresión a partir del genoma nuclear de ARNs doble cadena (ARNdc), en plantas, permite inducir silenciamiento génico en insectos que se alimentan de ellas. Sin embargo, esta estrategia se ve comprometida por la baja eficiencia de captación de ARNs pequeños interferentes por los animales. Por su parte, los plástidos son capaces de acumular ARNdc largos ya que carecen de la maquinaria de silenciamiento citosólica. Esta estrategia mostró ser altamente efectiva para inducir silenciamiento génico en insectos masticadores, pero se cuenta con poca evidencia sobre su efectividad en hemípteros. Estos insectos son responsables de importantes pérdidas económicas debido no solamente al daño que generan en los cultivos al alimentarse sino también como vectores de fitoplasmas y virus. Por este motivo, se decidió evaluar si la expresión de ARNdc en plástidos es una estrategia viable para inducir silenciamiento génico en hemípteros fitófagos, con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias biotecnológicas para el control de plagas. Se decidió trabajar con los insectos hemípteros Mizus persicae y Bemisia tabaci, especialmente con M. persicae, el pulgón verde del duraznero, debido a que es responsable de importantes pérdidas en el rendimiento de cultivos, incluyendo a las solanáceas. En primera instancia se generaron plantas transformadas genéticamente a nivel del genoma plastídico (transplastómicas) que expresan ARNdc largos en estructura de horquilla que poseen homología con los siguientes genes blanco en insectos: Mpc002 y subunidad E de la V-ATPasa de Myzus persicae, su homólogo de Bemisia tabaco; como control se incluyó la secuencia correspondiente al gen gfp de Aequorea victoria. MpC002 es un efector que promueve la colonización de M. persicae, mientras que la subunidad E de la V-ATPasa es una proteína esencial y su silenciamiento resulta letal. Para generar dichas plantas, se ensambló el vector de transformación plastídica pARNiPol. Las plantas obtenidas resultaron incapaces de transmitir los transgenes a la descendencia y mostraron inestabilidad genómica. La caracterización molecular realizada por PCR y Southern blot mostró rearreglos de las copias del plastoma transformado y la pérdida de parte de la construcción, incluyendo los brazos de la horquilla e intrón. Para determinar si la inestabilidad genómica es consecuencia de recombinaciones homólogas inducidas por el largo de los brazos de la horquilla, se generó un nuevo vector denominado pARNiPol/gfpSh. Éste está diseñado para la expresión de horquillas de ARN con homología con gfp, siendo los brazos de la horquilla más cortos. La planta resultante se comportó del mismo modo que las anteriores, indicando que lo observado no se debía a dicho motivo. Debido a las dificultades encontradas, se produjo una tercera generación de plantas transplastómicas para la expresión de ARNdc en plástidos. Para esto se generó una construcción diseñada para producir ARNdc con homología a Mpc002 a partir del vector pTomCT/gfp, diseñado para expresar ARNdc largos a partir de promotores enfrentados. Las plantas obtenidas mostraron ser fenotípicamente indistinguibles de las no transformadas y capaces de transmitir los transgenes a la descendencia. La caracterización molecular mostró la presencia de los elementos subclonados en ausencia de rearreglos, y su homoplastía. Se detectaron los transcriptos esperados mediante la técnica de northern blot y se corroboró su naturaleza de ARNdc mediante un ensayo de degradación con ARNsa A. Los desafíos de M. persicae con las plantas pTomCT mostraron que la planta pTomCTMp/Mpc002 b es eficiente reduciendo aproximadamente un 30% los niveles de acumulación de Mpc002 en los insectos. Adicionalmente se cuantificó el número de ninfas producidas a partir de insectos alimentados con las plantas pTomCT o control, y no se observaron diferencias significativas en su número ni supervivencia. En paralelo, para comparar la eficiencia de inducción del silenciamiento génico entre plantas transplastómicas y transgénicas nucleares, se generaron plantas que expresan ARNdc dirigidos hacia los mismos blancos que las plantas pARNiPol originales. La transformación de las plantas se confirmó por PCR y se está evaluando la acumulación de los transcriptos específicos. Los resultados aquí presentados muestran que la expresión de ARNdc largos en plástidos es una estrategia viable para inducir silenciamiento génico en Myzus persicae, y abre la posibilidad a utilizar esta tecnología para el desarrollo de plantas resistentes a dichos insectos y para estudiar la función de sus genes. |l spa | |
| 520 | 3 | |a Nuclear expression of dsRNAs in plants allows for Host Induced Gene Silencing in insects that feed on them. Unfortunately, this strategy can be highly variable in terms of gene silencing due to the inefficient uptake of small dsRNAs by animal gut cells. However, plastids can accumulate long dsRNAs due to the lack of the cytosolic silencing machinery. This strategy was proven to be highly effective inducing Host Induced Gene Silencing in chewing insects, but there is little evidence regarding its effectiveness in hemipterans. As they are responsible for important economic losses in crops due to their feeding and acting as virus and phytoplasma vectors, we decided to evaluate if the expression of long dsRNAs in plastids is a viable strategy for inducing HIGS in phytophagous hemipterans with the aim of developing new biotechnological tools for their control. We decided to work with Mizus persicae and Bemisia tabaci as they are both responsible for important losses in several crops, including several solanaceous plants. First, we generated transplastomic plants (plants genetically transformed at the plastid genome level) that express long stem-loop RNAs against Mpc002, the gene encoding subunit E of the V-ATPase from M. persicae, its homologous from B. tabaci and gfp from Aequorea victoria. MpC002 is an effector protein that promotes M. persicae plant colonization, while the subunit E of the V-ATPase is an essential protein, and its silencing is lethal. For plant transformation, we developed a plastid transformation vector named pARNiPol. The resulting plants were unable to transmit the transgenes to their descendancy and they showed genetic instability. Molecular characterization by PCR and Southern blot showed rearrangements in the transformed plastome copies and the deletion of transgenes, including the ones coding for the intron and stem. To evaluate if this was caused by homologous recombination due to the length of the stem arms, we made a new construct named pARNiPol/gfpSh. It’s designed for the expression of stem-loops RNAs against gfp but with a shorter stem. Resulting plant behaved similarly to previous pARNiPol plants, suggesting that stem length was not responsible for the observed phenotype. We then decided to make a second generation of transplastomic plants to express dsRNAs. For this, we made a construct designed for the expression of dsRNAs against Mpc002 based on the pTomCT/gfp vector, designed for the expression of dsRNAs from opposite promoters. Resulting plants were phenotypically indistinguishable from non-transformed and could transmit transgenes to their offspring. Molecular characterization showed no rearrangements, the presence of the transgenes and their homoplastic state. We corroborated the accumulation of dsRNAs by northern blot and protection assays involving RNaseA. Infestation assays with M. persicae on pTomCT plants show that pTomCT/Mpc002 b is efficient reducing endogenous Mpc002 levels in aproximately 30%. Additionally, nymph production and survival were assessed. We found no significant differences in nymph number nor survival. In parallel, we wanted to compare the silencing efficiency between transplastomic and nuclear transgenic plants expressing dsRNAs. For this we generated nuclear transgenic plants that express dsRNAs against the same targets that the original pARNiPol plants. Genome transformation was confirmed by PCR and transcript accumulation is currently being evaluated. Our results show that the expression of long dsRNAs in plastids is a viable strategy to induce HIGS in M. persicae and opens the possibility of using this technology for the development of plants resistant to aphids and to study the function of their genes. |l eng | |
| 540 | |2 cc |f https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar | ||
| 653 | 1 | 0 | |a ARN |
| 653 | 1 | 0 | |a DOBLE CADENA |
| 653 | 1 | 0 | |a TRANSPLASTOMICA |
| 653 | 1 | 0 | |a HIGS |
| 653 | 1 | 0 | |a BEMISIA TABACI |
| 653 | 1 | 0 | |a MYZUS PERSICAE |
| 653 | 1 | 0 | |a Mpc002 |
| 653 | 1 | 0 | |a V-ATPasa |
| 653 | 1 | 0 | |a RESISTENCIA A INSECTOS |
| 690 | 1 | 0 | |a RNA |
| 690 | 1 | 0 | |a dsRNA |
| 690 | 1 | 0 | |a TRANSPLASTOMIC |
| 690 | 1 | 0 | |a HIGSS |
| 690 | 1 | 0 | |a V-ATPase |
| 690 | 1 | 0 | |a INSECT RESISTANCE |
| 690 | 1 | 0 | |a BEMISIA TABACI |
| 690 | 1 | 0 | |a MYZUS PERSICAE |
| 690 | 1 | 0 | |a Mpc002 |
| 700 | 1 | |a Bravo Almonacid, Fernando Félix | |
| 700 | 1 | |a Segretin, María Eugenia | |
| 700 | 1 | |a Ulloa de la Serna, Rita María | |
| 700 | 1 | |a Hopp, Horacio Esteban | |
| 700 | 1 | |a Vázquez Rovere, Cecilia | |
| 700 | 1 | |a Salvador, Ricardo | |
| 856 | 4 | |q application/pdf | |
| 931 | |a FBMC | ||
| 961 | |b tesis |c IR |e ND | ||
| 962 | |b info:eu-repo/semantics/publishedVersion |a info:ar-repo/semantics/tesis doctoral |a info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | ||
| 999 | |c 90772 | ||