Clonado y expresión de ciclodextrina glucosiltransferasa de Paenibacillus barengoltzii en sistemas GRAS

Fil: Caminata Landriel, Soledad. Universidad Nacional de Luján; Argentina.

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Caminata Landriel, Soledad
Otros Autores: Costa, Hernán
Formato: Tesis Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:Español
Español
Publicado: Universidad Nacional de Luján 2026
Materias:
Almidón
Bacillus subtilis
Acceso en línea:http://ri.unlu.edu.ar/xmlui/handle/rediunlu/3733
Aporte de:
REDIUNLu - Repositorio Digital Institucional de Acceso Abierto - Universidad Nacional de Luján (UNLu) de Universidad Nacional de Luján (UNLu)
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spelling I62-R168-rediunlu-37332026-02-12T17:01:37Z Clonado y expresión de ciclodextrina glucosiltransferasa de Paenibacillus barengoltzii en sistemas GRAS Caminata Landriel, Soledad Costa, Hernán Almidón Bacillus subtilis Fil: Caminata Landriel, Soledad. Universidad Nacional de Luján; Argentina. La ciclodextrina glucosiltransferasa (EC 2.4.1.19) aislada de Paenibacillus barengoltzii cepa DF 9R (WT-CGTasa) es una enzima monomérica de 75 kDa. Esta enzima pertenece a la Familia 13 de las glucósido hidrolasas y cataliza diferentes reacciones de transglicosilación α-1,4 inter e intramoleculares a partir de almidón. Desde el punto de vista biotecnológico, son muy relevantes la reacción de ciclación que genera ciclodextrinas (CD) y la reacción de desproporción que produce maltooligosacáridos (MOS). Las CD son compuestos cíclicos, no reductores de bajo grado de polimerización con estructura de cono truncado que permiten formar complejos con diversas moléculas, a las que les modifican sus propiedades fisicoquímicas. Los MOS son oligosacáridos lineales formados por dos (G2) a diez (G10) residuos de glucosa unidos mediante enlaces glucosídicos α-1,4. Son un tipo novedoso de oligosacáridos funcionales con interesantes aplicaciones en alimentos. La celiaquía es una enteropatía de naturaleza autoinmune que afecta al 1 % de la población mundial. Se desencadena luego del consumo de gluten en personas genéticamente predispuestas. La fracción proteica presente en el endospermo de algunos cereales como el trigo, la avena, la cebada y el centeno forma el gluten en condiciones de humedad y acción mecánica, es decir, durante el amasado. La elaboración de productos destinados a personas que padezcan celiaquía representa un desafío para la tecnología de alimentos. En particular, en la industria panadera el gluten se comporta como una proteína estructural, generando masas viscoelásticas, con gran capacidad de retención de gases y migas aireadas y homogéneas. En formulaciones donde no está presente el gluten, se forman masas líquidas y con poca capacidad de retención de burbujas de gas. Los panes que se obtienen con estas formulaciones poseen menor volumen y las migas son más heterogéneas y compactas. También se suelen obtener panes con menor vida útil por el rápido endurecimiento de la miga durante el almacenamiento. Este proceso se debe a la retrogradación del almidón presente en las formulaciones y es causado por la reestructuración de los polímeros del almidón, luego de la gelatinización. Es decir, las moléculas de amilosa y amilopectina, que presentaban una estructura amorfa durante la gelatinización del almidón, se vuelven a acomodar en una estructura rígida y semicristiana cuando la temperatura comienza a descender. Este proceso comienza a ocurrir desde las primeras horas de almacenamiento II de los panificados y depende de la proporción de los polímeros presentes en los almidones que forman la mezcla panadera. El uso de enzimas antienvejecimiento es frecuente en la industria panadera, incluso en mezclas que contienen gluten. Entre ellas se encuentran las CGTasas y las MFAsas, un grupo especial de α-amilasas que pueden producir un tipo particular de MOS como producto mayoritario al hidrolizar almidón. Con el propósito de ser aplicada en la elaboración de panes libres de gluten, la enzima WT-CGTasa fue clonada y expresada en dos sistemas GRAS: Bacillus subtilis cepa WB800, que produjo la enzima recombinante denominada BS-CGTasa; y Pichia pastoris cepa SMD1168, donde se obtuvo la glicoproteína denominada PP-CGTasa. La cepa de B. subtilis utilizada es deficiente en ocho proteasas y libera al espacio extracelular las proteínas recombinantes que produce. Mientras que la cepa de P. pastoris es deficiente en una proteasa, también libera al espacio extracelular las proteínas recombinantes y, además, incorpora N-glicosilaciones a dichas proteínas. Para obtener la enzima BS-CGTasa se utilizó el vector de expresión pCri-18a, mientras que para obtener la enzima PP-CGTasa, se utilizó el vector de expresión pPICZαA. La mejor producción de BS-CGTasa se obtuvo luego de 7 h de inducción con IPTG en el medio LB, mientras que la de PP-CGTasa, luego de 120 h y agregado diario de metanol al medio BMMY. Las enzimas recombinantes purificadas mediante cromatografía de afinidad a α-CD poseen su mayor actividad a pH 6,0 y temperaturas de 50 y 60 ºC. Además, son estables por una hora en el rango de pH 6,0 a 11,0. La enzima BS-CGTasa es estable por una hora en el rango de temperaturas de 20 a 40 ºC, mientras que la enzima PP-CGTasa es estable en el rango de temperaturas de 20 a 50 ºC. La purificación de PP-CGTasa mediante cromatografía de intercambio aniónico en FPLC permitió obtener dos fracciones con actividad enzimática, PP-CGTasa-A y PP-CGTasa-B, con idéntico procesamiento del N-terminal, pero con diferentes pesos moleculares (80-83 kDa). Ambas fracciones presentaban N-glicosilaciones y fueron deglicosiladas con diferentes tratamientos enzimáticos obteniendo por un lado la fracción de glúcidos responsables de las glicosilaciones y por otro la fracción proteica. La fracción de glúcidos de ambas fracciones se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con intercambio aniónico débil y detección fluorescente (WAX-HPLC-FLR) y mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento con interacción hidrofílica y detección fluorescente (HILIC-UPLC-FLR). Dichos estudios permitieron comprobar que III los N-oligosacáridos incorporados correspondían a estructuras de alta manosa, conformadas por 8 a 13 residuos de manosa (Man8-13GlcNAc2) y que dichos oligosacáridos no presentaban incorporación de grupos fosfato ni residuos de ácido siálico. Por otro lado, se llevó a cabo el estudio de la fracción proteica de ambas fracciones mediante digestión con tripsina y quimotripsina y posterior análisis de los péptidos generados mediante espectrometría de masas utilizando ESI-TRAP, MAILDI TOF y ESI- Orbitrap. Dicho estudio permitió confirmar que PP-CGTasa-A presenta 5 residuos de Asn glicosilados en posición 93,160, 205, 655 y 666; mientras que la otra fracción posee 4 residuos de Asn modificados: 205,594, 655 y 666. Ambas enzimas recombinantes presentaron valores de Km similares a los de la enzima WT-CGTasa. Sin embargo, las dos fracciones de PP-CGTasa presentaron un valor de Vmax inferior al de WT-CGTasa. El análisis del modelo molecular de la estructura terciaria de ambas fracciones (glicoformas) permitió inferir que los restos de alta manosa incorporados durante la N-glicosilación podrían interferir en la velocidad de formación de β-CD. También se evaluó, mediante HPLC, la producción de CD y de MOS de BS-CGTasa y PP-CGTasa sobre diversos sustratos libres de gluten. Los mejores rendimientos de producción de esos oligosacáridos se obtuvieron utilizando féculas de papa y de mandioca, harina de arroz y almidón de maíz como sustratos. Al comparar el costo y tiempo de producción necesarios para obtener cada enzima recombinante, la presencia de modificaciones postraduccionales, los rendimientos obtenidos y el factor de purificación, se concluyó que BS-CGTasa resulta más adecuada para ser evaluada en la elaboración de panes libres de gluten. La misma enzima fue utilizada para producir una mezcla de MOS en un sistema continuo en biorreactor, utilizando almidón de mandioca como sustrato y glucosa como aceptor de la reacción de desproporción. Los panes libres de gluten se elaboraron en la Planta Piloto de la Universidad Nacional de Luján (UNLu), utilizando una mezcla panadera constituida por fécula de mandioca, harina de arroz y almidón de maíz en una relación 3:3:4. Se realizaron tres tratamientos: 1) control, sin la incorporación de ningún ingrediente adicional a la mezcla panadera, 2) adición de tres unidades diferentes de BS-CGTasa (0,005, 0,05 y 50 U) y 3) incorporación de tres cantidades diferentes de mezcla de producción de MOS ( 0,17, 1,70 y 5,10 mg). En todos los tratamientos se determinó el volumen específico del pan, la IV forma y distribución de los alveolos en la miga y el color de la corteza. Además, se determinó la dureza y la actividad de agua en la miga a lo largo del tiempo. Los resultados indicaron que con el agregado de 0,005 U de la enzima BS-CGTasa y de 1,70 y 5,10 mg de mezcla de producción de MOS por g de mezcla seca se obtuvieron panes libres de gluten con mejores propiedades tecnológicas que las obtenidas para el pan control. Los resultados más promisorios para la elaboración de panes libres de gluten se obtuvieron con la mezcla de producción de MOS. Por este motivo, se realizó su caracterización y se propondrá la incorporación de dicha mezcla al Código Alimentario Argentino (CAA). Hasta el momento, no hay registros de elaboración de panificados con la adición de MOS a la mezcla panadera. Se espera que los resultados obtenidos en esta tesis permitan la obtención futura de panes libres de gluten con calidad tecnológica aceptable y, de este modo, poder aumentar la disponibilidad de estos productos en el mercado. 2026-02-12T12:59:52Z 2026-02-12T12:59:52Z 2023 Thesis info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://ri.unlu.edu.ar/xmlui/handle/rediunlu/3733 spa es info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ application/pdf application/pdf Universidad Nacional de Luján

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