Caracterización genómica y funcional de los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 que codifican para proteínas de tipo acuaporinas en Arabidopsis thaliana

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En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua estáespacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido deagua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio tempranode la microespora y co...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Pérez, Juliana Andrea
Otros Autores: Muschietti, Jorge Prometeo
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2015
Materias:
ACUAPORINAS DE POLEN
TRANSPORTE DE AGUA
REPRODUCCION
AQUAPORINS
POLLEN
WATER TRANSPORT
REPRODUCTION
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5722_Perez
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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El volumen de polen, aligual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, seadapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación enel estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polenproporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, losnutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilasestigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no seconocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional de agua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas enel transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubopolínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en losgranos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. Eneste trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesosasociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad desecuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos entándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten losmismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en laselectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones deexpresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos deexpresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante laelongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraronuna fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubospolínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentesy específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieronplantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN dobleknockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidadafectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociadasolamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducciónde la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granosde polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen,reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente encondiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de susrespectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas decomplementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal seobservó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en lamembrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una bajapermeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa invitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforiladosespecíficamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresadaen polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. Enresumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaríainvolucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. In Angiosperms, reproduction involves processes where water and solutes transport istemporally and spatially regulated. During pollen development, pollen water content startsincreasing significantly at the early microspore stage and continues to increase until partialdehydration. Then, pollen volume decreases during anther and pollen dehydration and, similarto water content, adapts to environmental conditions during dispersal, increasing later duringrehydration. In plants with dry stigmas, regulated pollen hydration provides an effective earlybarrier to incompatible pollinations. Water, nutrients, and other non-polar small molecules aretransported rapidly into pollen from the stigma papillae to promote its germination bymechanisms that are still unknown. Then, additional entry of water through the plasmamembrane allows cytosolic adjustment of ions (Ca2+, K+, H+, and Cl–) and maintenance ofturgor pressure during tip elongation. It has been proposed that aquaporins may mediate waterand solute transport during pollen germination and pollen tube growth. In Arabidopsis thaliana only 4 genes (out of 35 loci) are specifically expressed in mature pollengrains and/or pollen tubes: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 and AtNIP4;2. Here, we show theinvolvement of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 in reproduction processes. Interestingly, AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are genes with high nucleotide sequence identity, similar gene structure (5 exons, 4introns), and disposed in tandem. At protein level, they have 84% amino acidic identity, andshare the same two NPA motifs and the ar/R constriction (W,V,A,R), involved in transportselectivity. However, they displayed different expression patterns. Real time PCR assaysshowed that AtNIP4;1 has low relative expression levels in mature pollen while AtNIP4;2 peaksduring pollen tube elongation. Additionally, NIP4;1promoter::GUS flowers showed strong GUS activity in mature pollen grains, remaining in the pollen tubes, whereas NIP4;2promoter::GUS flowers, showed strong GUS activity upon pollen tube germination. Therefore, we hypothesized that they could have a functional redundancy during reproduction,even though they may play different roles in pollen development, pollination and/orfertilization. In order to perform in vitro and in planta physiological experiments, we obtainedsimple mutant T-DNA insertion lines and developed double knockdown amiRNA lines. Simplemutant and double knockdown plants showed affected fertility parameters: reduced number ofseeds per silique, and distorted segregation ratios. Furthermore, double knockdowns displayedreduced mature pollen grain viability and diameter, increased number of immature pollen grains (increased number of pollen grains arrested at uni- and bi-cellular stages), defects in pollenrehydration, reduced germination rate and pollen tube length (specially under low boric acidconditions), and increased percentage of non-pollinated flowers. Complementation linesexpressing eGFP-tagged AtNIP4;1 and AtNIP4;2 under their own promoters, in each mutantline background, rescued the mutant phenotype in segregation analysis. Additionally, confocalmicroscopy showed that eGFP-AtNIP4;1 and -AtNIP4;2 are localized in the plasma membraneand intracellular vesicles of pollen grains (AtNIP4;1) and tubes (AtNIP4;1 and AtNIP4;2). Functional expression of eGFP-AtNIP4;1 and eGFP-AtNIP4;2 in Xenopus laevis oocytesconfirmed that both aquaporins have relatively low water permeability and significant glyceroltransport. In vitro kinase assays showed that the C-terminal domains of AtNIP4;1 and AtNIP4;2are specifically phosphorylated at Ser267 by AtCPK34, a pollen Calcium-dependent proteinkinase, suggesting that phosphorylation might regulate their transport activity in planta. Insummary, the obtained results suggest that AtNIP4;1 might be involved mainly in pollendevelopment, pollination, and germination, and AtNIP4;2 could play a major role in pollen tubeelongation. Fil: Pérez, Juliana Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2015-03-25 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5722_Perez

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