Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el...
Guardado en:
| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2010
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4625_Sarnacki |
| Aporte de: |
| Sumario: | La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente. |
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